Diagnostica molecolare: PCR in tempo reale
Attualmente, nella diagnostica molecolareÈ stato sviluppato il meccanismo della reazione a catena della polimerasi (PCR), che è diventato l'impulso per lo sviluppo di un gran numero di metodi diagnostici per le malattie basati sulla definizione di materiale genetico. Per la PCR in tempo reale, viene utilizzato un frammento del gene (in particolare l'acido nucleico) dell'agente causale della malattia, che non si trova in altri individui.
Il principio della PCR è la riproduzioneun certo frammento del DNA del patogeno milioni di volte con l'aiuto della DNA polimerasi in uno speciale apparato chiamato termociclatore, che fornisce una ripetizione ciclica del regime di temperatura secondo un dato programma.
La diagnosi di PCR consente di ripetere la serieamplificazione, preservando l'attività dell'enzima. Quando l'amplificazione passa senza impedimenti, in un ciclo il numero di copie di una determinata regione del DNA patogeno raddoppia, dopo trenta cicli: centodieci volte. Questo è il motivo per cui la PCR viene utilizzata nella diagnosi per identificare agenti patogeni di dimensioni sufficientemente piccole, il cui rilevamento è impossibile senza questo.
Va notato che l'RNA non può essere una matriceper la PCR in tempo reale. Pertanto, al fine di rilevare l'RNA virale, è necessario ottenere il DNA, corrispondente al suo frammento, prima dell'amplificazione. La reazione a catena della polimerasi consente di misurare il DNA e l'RNA dell'agente patogeno. Le informazioni ottenute in questo modo vengono utilizzate per monitorare l'efficacia della terapia utilizzata, nonché per valutare la prognosi clinica.
Inoltre, la PCR in tempo reale non è necessariaazioni aggiuntive riguardanti la decifrazione del DNA o degli ampliconi studiati, che servono da barriera alla diagnosi corretta e portano a risultati falsi. Questo approccio ci consente di non utilizzare lo stadio dell'elettroforesi, che porta a una riduzione del rischio di infezione con i prodotti di reazione a catena della polimerasi. Inoltre, in connessione con la riduzione del numero di manipolazioni con il patogeno, il tempo dello studio è ridotto, il suo processo è semplificato e la probabilità di errori è ridotta. La PCR consente anche di determinare il numero iniziale di copie del DNA del patogeno in uno studio clinico, che aiuta a identificare i periodi di esacerbazione delle malattie e ad adottare misure tempestive per curare il paziente.
Oggi c'è un gran numerometodi per fissare l'amplificazione in tempo reale. Le più frequentemente utilizzate sono varie tecniche che applicano sonde fluorogeniche correlate all'amplicone, la cui intensità di radiazione varia a seconda dell'accumulo dell'amplicone e viene registrata in tempo reale utilizzando uno strumento speciale chiamato amplificatore con modulo ottico. Questo fornisce un alto livello di sensibilità dell'analisi. Allo stesso tempo, il prodotto PCR può essere rilevato insieme a un'enorme quantità di sottoprodotti, in un momento in cui non viene spesso notato quando si utilizza l'elettroforesi.
Viene utilizzata la PCR in tempo realecampioni positivi, di controllo e negativi. Pertanto, i campioni positivi e negativi durante lo studio vengono analizzati come campioni separati, mentre il campione di controllo viene introdotto in ciascun campione e passa attraverso tutte le fasi dell'analisi.
Oggi c'è un gran numerodispositivi per eseguire la reazione a catena della polimerasi. Questi includono Bio-Rad, Applied Biosystems, Cepheid o Roche. Ognuno di loro ha vantaggi e svantaggi.
Va notato che la PCR è un metodo diagnostico,utilizzato in grandi centri scientifici, di ricerca e diagnostici di vari paesi del mondo, perché offre l'opportunità di interpretare istantaneamente i risultati ottenuti.
